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Cy3-NHS活化酯的水溶性较低，所以在水相的标记反应体系内需要使用有机共溶剂，常用有机溶剂包括DMF，DMSO和乙腈等。如需标记的分子对有机溶剂敏感，可选择磺化花青素，即sulfo-Cy3-NHS活化酯。两者的光谱性质几乎一致，因此大部分应用可相互替换。两者的主要区别在于：磺化染料是水溶性的，在水相的标记反应体系内不需要使用有机共溶剂，并且降低染料在水中聚集的可能性，增强标记效率。

Cy3 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。它的荧光很亮，对pH不敏感，并且处在肉眼较敏感的可见光区，在绝大多数荧光仪器上都可使用。Cy3可以用来标记蛋白，抗体，多肽，核酸分子等。

NHS活化酯是生物标记反应中最常用的活化基团。NHS活化Cy3分子中的羧基，让它可以和目标生物分子上的胺基（主要伯胺）反应生成稳定的酰胺键，从而把Cy3分子标记到生物大分子上。由于游离胺基是蛋白，抗体，多肽表面的常见官能团（来自于赖胺酸侧链），Cy3-NHS可以和它们直接反应。核酸分子中天然不带游离胺基，只有胺基修饰过的RNA或者DNA才可以和Cy3-NHS反应。

• 琥珀酰亚胺活化酯对湿气敏感，在含水条件下会缓慢水解为羧酸，失去对氨基的标记能力。活化酯一般在-20℃干燥保存，使用前请预先从冰箱中取出，平衡到常温后再打开瓶盖。NHS活化酯用无水溶剂（如无水DMSO、无水DMF）溶解后也无法长时间保存，应尽快使用（尽量24h内），因为溶剂中残留的微量水分子也会让活化酯水解。活化酯更不能在水溶剂中保存。
  
• 常见添加剂，比如叠氮化钠（≤ 3mM or 0.02%）或thimerosal（≤ 0.02mM or 0.01%），对蛋白标记反应没有影响，但是20～50%的甘油会降低标记反应效率。此外，Tris、甘氨酸等带伯氨基的缓冲盐会让NHS活化酯试剂失活，严禁在此类溶液中进行标记反应。

• 标记准备工作：
  
  • 反应体系溶剂：标记一般在混合溶剂（水溶液+少量有机溶剂）中进行。sulfo-Cy由于水溶性强，不需要有机溶剂助溶，可在水溶液中标记，避免有机溶剂对生物样品的刺激和伤害。NHS活化酯在微碱性条件下反应的活性比较高，综合考虑反应速度和活化酯水解速度，一般选择在pH8.5左右的pH值范围进行标记反应。最优化的反应缓冲盐是50mM的硼酸钠溶液（50mM Na3BO3,pH8.5）。除此以外，磷酸钠缓冲盐PBS（0.1M Na3PO4,0.15M NaCl,pH7.2～7.5）,NaHCO3溶液（0.1M NaHCO3,pH8.3～9.0）也可以用于标记反应。带有氨基的缓冲液（e.g.Tris或甘氨酸）会自身和NHS活化酯反应，所以不可使用，如果蛋白样品中含有这些缓冲盐，必须通过透析或者除盐柱将这些氨基盐除掉后才可以用于标记反应。如果标记对象是高分子、小核酸等耐有机溶剂材料，标记反应也可以在纯有机溶剂体系（比如甲醇、乙腈或者氯仿等）中进行，纯有机溶剂体系可以降低NHS活化酯的水解速度，从而在较低的染料/对象比例下实现高效标记（需加入有机碱比如三乙胺促进反应进行）。
    
  • 染料母液配制：Cy系列NHS活化酯染料对湿气很敏感。为了避免空气中水汽在低温样品表面凝结失活样品，低温冰箱中取出的活化酯在室内放置到室温后再打开瓶盖进行母液配制。
    染料一般用无水DMF或无水DMSO溶解，推荐母液浓度为10mg/mL。母液也可以配制为1mg/mL或者其它浓度，以便更准确的移液操作。如果对一些特别敏感的蛋白质样品，推荐使用sulfo-Cy系列染料，这样可以将染料直接加入反应水溶液体系中，回避使用有机溶剂。
    
  • 染料标记比例：为实现每个蛋白标记大于1个染料分子的目标，在混合溶剂反应体系中，染料/标记对象的摩尔比例一般是5-10/1；纯有机溶剂体系中可以降低到约3/1。为提高标记效率，应尽可能在高浓度、小反应体积条件下中进行，比如标记蛋白质，蛋白质的浓度最好在1～10mg/mL。
• 标记反应步骤：
  
  • 将需要标记的蛋白质溶液转移到反应小管中。
    
  • 根据染料标记摩尔比例，加适量的染料母液入反应小管中，用移液器上下轻轻打动混匀。
    常温下静置或轻微混动，反应1～5小时，反应时间延长有助于提高标记效率，最多可以标记过夜。对于蛋白质等敏感材料，反应中有机溶剂体积比控制在5%左右，如果有大量染料析出（疏水性Cy染料），可适量增加体积到10%或更高，如果是磺化染料，也可以在水中直接标记。
    
  • 利用透析，或者除盐柱，除去未标记的游离染料分子。也可以采用硫酸铵沉淀法或乙醇沉淀法等方法纯化样品。透析时，为了快速的透出染料分子，请采用至少截留分子量>10KDa的透析袋，最好每4个小时更换透析液，重复更换3次。凝胶过滤法，比如除盐柱，也可以纯化蛋白标记，虽然这个方法比较快捷，但是效率可能会不如透析法。
    
  • 在避光条件下，将纯化后的蛋白样品储存在4℃冰箱，可至1个月。或者加入冷冻保护剂、分装后放入-20℃冰箱，长期保存。
• 计算标记程度：
  每种染料都有一个特定的消光系数ε。通过测定最大激发峰（即最大吸收峰）的吸收值，并结合这个ε参数，可以精确计算出染料分子的浓度，再除以蛋白的浓度就可以得到染料标记的程度（即每个蛋白平均标记了几个染料分子）。
  
  • 利用BCA或者其他蛋白质测定试剂盒测定标记后的蛋白质浓度，并根据蛋白质分子量，计算出样品蛋白质的摩尔浓度C_protein。
    
  • 查询首页的Cy染料光学特性表，找到染料最大吸收峰的波长（即Ex的数值，比如Cy3染料的是554nm）。在紫外分光光度计上面，采用1cm光程的比色皿，测定最大吸收峰的吸收值A_max。染料对光的吸收很强，测量前一般要将少量样品取出进行稀释再测吸收值。根据吸收值，计算染料分子的摩尔浓度，C_dye = (A_max x稀释倍数)/消光系数ε，单位是M(mol/L)。
    
  • 计算标记程度，即n = C_dye/C_protein。注意，务必将蛋白质和染料的浓度换算成统一单位后再计算。